在生命科學與臨床醫學研究中，傳統單一的細胞培養已越來越難以滿足復雜微環境的研究需求。為了更真實地模擬體內細胞間相互作用，共培養技術逐漸成為研究細胞互作與微環境調控的重要工具。

本期細胞學堂將盤點常見共培養體系及實驗關鍵點，幫助您快速選擇適合自身實驗需求的方案。

一、什么是細胞共培養？

細胞共培養，是指將兩種或兩種以上類型的細胞，在同一實驗體系中共同培養，以模擬體內細胞間相互作用的一類技術。

細胞共培養的概念由來已久。早在1911年，研究人員便在雞胚胎組織的體外培養中觀察到不同組織之間細胞的遷移與相互作用。20世紀70年代，研究人員初次嘗試利用小鼠成纖維細胞系（3T3）作為飼養層細胞，與人原代表皮細胞共培養，這也成為現代細胞共培養體系的雛形。

隨著腫瘤微環境、干細胞、免疫治療及類器官等研究的快速發展，傳統的單一細胞培養已越來越難以準確模擬體內復雜的細胞互作環境。相比單一細胞培養，共培養體系能夠更真實地再現細胞間的物理接觸、旁分泌調控及微環境信號傳遞，因此被廣泛應用于腫瘤研究、組織工程、藥物篩選及再生醫學等領域。

二、常見共培養體系及特點

細胞共培養根據細胞間是否直接接觸以及培養空間結構的不同，分為多種類型（表1）。

表1. 常見共培養體系及分類方式

1、直接共培養

直接共培養是指兩種或多種細胞在同一培養體系內共同生長并發生直接接觸。細胞可通過表面受體結合、間隙連接及旁分泌因子等途徑實現信息交換，形成物理接觸與化學信號的雙重作用模式[1]。

直接共培養尤其適用于免疫突觸形成、細胞黏附及受體激活等研究。 但由于不同類型細胞混合生長，實驗后細胞分離及信號溯源的難度也會相應增加。

根據培養方式不同，直接共培養包括以下兩種方式：

●混合共培養

將兩種或多種細胞直接混合培養，使細胞間充分接觸。例如，將NK-92細胞和K-562細胞混合共培養，可用于研究免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用[2]；

●飼養層共培養

利用支持性細胞為目標細胞提供生長所需的微環境。例如，以間充質基質細胞（MSCs）作為飼養層，與CD34+的造血干細胞/祖細胞（HSPCs）共培養，可用于研究基質細胞對造血干細胞/祖細胞活性的調控作用[3]。

2、間接共培養

間接共培養通過物理間隔阻止細胞間直接接觸，但允許分泌的細胞因子、外泌體、代謝產物等穿過屏障進行信息交換。

與直接共培養相比，間接共培養實驗可控性更高，更易區分信號來源，因此更適用于細胞間旁分泌作用及分子機制研究。

常見的細胞間接共培養包括Transwell系統和條件培養基培養。

●Transwell系統

通常由上下兩個培養室組成，中間以特定孔徑的半透膜隔開。上下室分別接種不同的細胞，兩種細胞不能直接接觸，但可通過分泌物穿過半透膜實現信號傳遞。

例如，在構建血腦屏障（BBB）模型時，可將腦微血管周細胞和星形膠質細胞混合接種于小室膜的下底面，待細胞匯合度達到90%后，再將腦微血管內皮細胞接種至膜的上底面[4]，以此模擬血腦屏障的多細胞微環境。

●條件培養基培養

先單獨培養A細胞，收集含有A細胞分泌物的培養基上清，并將其作為條件培養基用于培養B細胞，從而研究A細胞分泌的可溶性因子對B細胞的功能狀態的影響。

例如，收集NIH/3T3細胞培養24 h后的上清液作為條件培養基，單獨培養腸神經膠質細胞，以研究NIH/3T3細胞分泌的因子對腸神經膠質細胞神經元分化的影響[5]。

3、3D共培養

3D共培養是指在三維（3D）空間實現多細胞協同培養，以構建更接近生理狀態的組織樣結構。相比2D共培養，3D共培養能更有效維持細胞極性、分化功能及組織特異性。

3D共培養主要技術形式包括以下兩種：

●無支架體系

通過懸浮液滴或低吸附培養器皿，誘導細胞自組裝形成球狀體。以腫瘤球模型為例，細胞經富集培養形成克隆球體，培養過程中細胞分泌的物質形成細胞外基質。

●有支架體系

主要包括水凝膠和固體支架兩種方式。

水凝膠包埋：基于細胞外基質（ECM）的各種天然成分構建，常用單一成分材料（如膠原蛋白、纖維蛋白、透明質酸、明膠、海藻酸鹽等），也可選用由多種蛋白質及相關分子復合而成的基質膠（Matrigel）。

固體支架：包括纖維狀支架、多孔支架等，多采用成分明確的合成材料。相對天然材料，合成材料具有更好的機械性能 ，且不存在生物降解帶來的未知影響。

此外，近年來快速發展的微流控技術進一步推動了3D共培養向動態微環境精準模擬方向發展。基于微流控芯片的3D細胞共培養技術被廣泛用于構建器官芯片，可模擬人體內各器官的生理過程并構建疾病模型，在病理研究和藥物開發中具有重大價值。

三、共培養三大易忽視關鍵點

1、共培養方式選擇

需根據實驗目的和需求，綜合評估各方面因素，選擇合適的共培養方式。

直接共培養適用于細胞間接觸依賴的研究（如免疫突觸形成、細胞黏附），但需考慮實驗后細胞分離的可行性。

間接共培養適合分析信號分子來源和功能，實驗重復性高，但無法模擬細胞間物理接觸的作用。

3D共培養可以模擬更真實復雜的人體環境，在腫瘤球和類器官構建、腫瘤微環境、組織修復等研究中具有明顯優勢[6]。但技術復雜度高，需優化支架材料和培養條件。

2、共培養培養基優化

細胞共培養體系需平衡不同細胞的生長需求，同時避免培養基本身對實驗結果產生干擾和影響。

預實驗篩選：在預實驗階段，可分別嘗試各細胞對應的培養基，或者將相關細胞的培養基按照等比例混合[4]，根據細胞生長情況選擇最合適的方案。

定制化培養基：針對特定共培養體系，可根據不同細胞對基礎培養基、血清、生長因子等的需求，定制專用共培養的培養基[1,2,5]。

3、細胞接種密度和比例優化

細胞接種密度會直接影響細胞間接觸程度及信號傳遞效率。適當提高細胞密度有助于增強細胞互作，但過高密度可能導致接觸抑制，反而影響細胞狀態及信號交流。

此外，不同細胞接種比例也會顯著影響細胞間的相互作用。

因此，正式實驗前需通過預實驗優化細胞接種密度和比例，摸索優的條件[1]。比如，在NK-92細胞對K-562細胞的殺傷實驗中，按照20:1、10:1、5:1和2.5:1設置效應細胞和靶細胞的比例，逐步摸索優條件[2]。

以上就是本次細胞共培養實驗關鍵要點。從培養原理、常見培養體系及特點到培養易忽視的關鍵點，幫助你輕松設計實驗方案。

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參考文獻

1. Vis, M. A. M. Microenvironmental advancement and miniaturization of human in vitro bone models. Eindhoven University of Technology.2023. 150p.

2. Freitas Monteiro M, Papaserafeim M, Andreani M, et al. NK Cytotoxicity Mediated by NK-92 Cell Lines Expressing Combinations of Two Allelic Variants for FCGR3. Antibodies (Basel). 2024 Jul 12; 13 (3):55.

3. Sinha S, Chakraborty S, Sengupta A. Establishment of a Long-Term Co-culture Assay for Mesenchymal Stromal Cells and Hematopoietic Stem/Progenitors. STAR Protoc. 2020 Nov 24;1 (3): 100161.

4. Lu Z, Ren S, Wang B, et al. Intranasally administered muse cells attenuate neurodegeneration in Parkinson's disease. J Transl Med. 2025 Dec 24; 23 (1): 1421.

5. Veríssimo CP, Carvalho JDS, da Silva FJM, et al. Laminin and Environmental Cues Act in the Inhibition of the Neuronal Differentiation of Enteric Glia in vitro. Front Neurosci. 2019 Sep 3; 13:914.

6. Xu J, Pham MD, Corbo V, et al. Advancing pancreatic cancer research and therapeutics: the transformative role of organoid technology. Exp Mol Med. 2025 Feb; 57 (1): 50-58.