骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，又稱骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，是存在于骨髓造血微環(huán)境中的一類多能成體干細(xì)胞，具有自我更新能力及向成骨、成軟骨、成脂等多向分化潛能，并分泌多種營養(yǎng)因子與免疫調(diào)節(jié)分子。大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（RatBMSCs）通常取自SD或Wistar大鼠股骨與脛骨的骨髓腔，經(jīng)全骨髓貼壁法或密度梯度離心法分離、擴(kuò)增獲得，是骨科組織工程、神經(jīng)損傷修復(fù)及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究的常用原代細(xì)胞模型，也是大鼠異位骨形成、骨折愈合等體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的種子細(xì)胞來源。
 

　　原代分離與培養(yǎng)原理

　　常用為全骨髓貼壁法：

　　脫頸處死SPF級大鼠，75%乙醇浸泡消毒，無菌取出股骨、脛骨，剪除骨骺；

　　用注射器吸取含10%FBS的低糖DMEM或α-MEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集紅色骨髓懸液；

　　經(jīng)200目篩網(wǎng)或70μm細(xì)胞篩去除骨碎片與團(tuán)塊，離心收集細(xì)胞沉淀重懸后接種于培養(yǎng)瓶；

　　置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱，48小時(shí)后半換液——未貼壁的血細(xì)胞與造血祖細(xì)胞隨換液被移除，BMSCs因具玻璃/塑料表面貼壁特性而保留并逐步鋪展為梭形成纖維樣克隆；

　　后續(xù)每2～3天換液，匯合80%～90%時(shí)按1:2～1:3胰酶消化傳代，通常P3～P5代細(xì)胞表型均一性較好。

　　密度梯度離心法（Percoll或Ficoll分離單個(gè)核細(xì)胞層）可提高初始純度但得率略低。

　　鑒定標(biāo)準(zhǔn)（ISCT2006指南參照）

　　大鼠BMSCs需滿足：

　　形態(tài)：梭形、旋渦狀生長，折光性好；

　　表面標(biāo)志物（流式）：陽性CD90（Thy-1）、CD29（整合素β1）、CD44、CD73（SH3/SH4），陰性CD34、CD45（造血系）、CD11b/c（巨噬細(xì)胞/粒細(xì)胞）、MHCII（大鼠多不表達(dá)或低表達(dá)）；

　　多向分化潛能驗(yàn)證：成骨誘導(dǎo)（抗壞命酸+β-甘油磷酸鈉+地塞米松）→茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)陽性；成脂誘導(dǎo)（胰島素+IBMX+地塞米松+吲哚美辛）→油紅O染色脂滴陽性；成軟骨誘導(dǎo)（TGF-β3+地塞米松+抗壞命酸）→阿爾新藍(lán)染色蛋白聚糖陽性。

　　主要應(yīng)用領(lǐng)域

　　組織工程與骨/軟骨修復(fù)：復(fù)合生物支架（如羥基磷灰石、膠原海綿）植入骨缺損或關(guān)節(jié)軟骨缺損大鼠模型評估新骨形成；

　　神經(jīng)損傷修復(fù)：脊髓損傷、腦缺血模型中鞘內(nèi)或局部移植BMSCs觀察運(yùn)動功能恢復(fù)（BBB評分）及神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF、NGF）分泌；

　　免疫調(diào)節(jié)與移植物抗宿主病（GVHD）研究：BMSCs可抑制T細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）生成，在大鼠同種異體移植模型中評估免疫耐受誘導(dǎo)；

　　藥物/基因治療載體：經(jīng)轉(zhuǎn)染攜載BMP-2、VEGF等基因的BMSCs用于局部因子持續(xù)釋放研究；

　　干細(xì)胞微環(huán)境（Niches）與衰老機(jī)制：比較不同代次、不同供體年齡BMSCs的端粒酶活性、ROS水平及成骨偏移趨勢。

　　大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以其易獲取、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)及與人MSCs高度同源的生物學(xué)行為，成為連接干細(xì)胞基礎(chǔ)研究與臨床前大動物實(shí)驗(yàn)之間的重要過渡模型，是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常用的原代干細(xì)胞資源之一。