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細(xì)胞培養(yǎng)污染是實驗室中常見且棘手的問題，一旦發(fā)生，不但會影響細(xì)胞的生長和形態(tài)，還可能改變細(xì)胞功能、性質(zhì)，導(dǎo)致實驗研究結(jié)果失真甚至前功盡棄。面對污染，細(xì)胞只能全部扔掉嗎？哪些污染還有挽救的可能？實驗室又該如何正確應(yīng)對？本期細(xì)胞學(xué)堂將從污染識別、應(yīng)急處理和預(yù)防措施三個方面，講解細(xì)胞污染后應(yīng)該如何應(yīng)對。
發(fā)現(xiàn)細(xì)胞異常后，首先要判斷污染類型，再決定是搶救還是棄用。
01細(xì)菌污染
細(xì)菌污染是最常見的污染類型，通常從污染發(fā)生到明顯爆發(fā)僅需1-3d。
典型表現(xiàn)
培養(yǎng)基快速渾濁；
培養(yǎng)基顏色明顯改變（通常變黃，因細(xì)菌產(chǎn)酸導(dǎo)致PH降低，使酚紅指示劑變黃）；
顯微鏡下可見快速移動的桿狀、球狀顆粒或者不移動的密密麻麻的黑點。
02真菌（霉菌、酵母菌）污染
真菌污染發(fā)展相對較慢，通常需要一周左右才出現(xiàn)明顯癥狀。
典型表現(xiàn)
霉菌污染：早期培養(yǎng)基保持澄清透亮不渾濁，不易察覺。隨著污染加重，霉菌形成肉眼可見的絨毛狀、菌絲狀或絮狀菌落；
酵母菌污染：顯微鏡下呈單個卵圓形或球形顆粒，可能會出芽形成更小的顆粒。
03支原體污染
支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)中最隱蔽的一類污染，普通光學(xué)顯微鏡下通常無法直接觀察到，需通過支原體檢測確認(rèn)。
典型表現(xiàn)
培養(yǎng)基不渾濁，無異味；
細(xì)胞的形態(tài)變差、貼壁能力下降；
細(xì)胞增殖速度變慢，甚至漂浮死亡；
細(xì)胞間隙會出現(xiàn)明顯的黑點。
04黑膠蟲污染
黑膠蟲污染是一種頗具爭議的污染類型，目前黑膠蟲是什么尚無明確定義。
典型表現(xiàn)
培養(yǎng)基不渾濁，保持澄清；
細(xì)胞周圍出現(xiàn)很多黑點和細(xì)胞碎片；
細(xì)胞狀態(tài)變差，增殖變慢；
更換培養(yǎng)基后黑點仍持續(xù)存在，并可隨傳代繼續(xù)擴散。
05交叉污染
雖然細(xì)胞間的交叉污染不像其它微生物污染比較常見，但卻是細(xì)胞培養(yǎng)中明確存在且后果嚴(yán)重的問題之一。由于肉眼或顯微鏡難以準(zhǔn)確判斷，一般需通過STR鑒定進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。
典型表現(xiàn)
細(xì)胞形態(tài)與既往特征不符;
功能實驗結(jié)果出現(xiàn)明顯偏差;
培養(yǎng)基通常無渾濁現(xiàn)象。
發(fā)現(xiàn)污染后應(yīng)立即隔離受污染的細(xì)胞，停止共用培養(yǎng)基、血清、PBS、胰酶、槍頭等試劑耗材，避免污染進(jìn)一步擴散。
1、分類處理
根據(jù)污染類型采取相應(yīng)措施：
輕度細(xì)菌污染可嘗試用10×雙抗或者雙抗原液潤洗兩遍細(xì)胞并持續(xù)觀察。重度細(xì)菌污染建議消殺后直接丟棄。
真菌污染較難根chu，且真菌孢子易飄散在空氣中污染實驗室環(huán)境，一旦出現(xiàn)真菌污染不建議保留，建議直接消殺后丟棄。
支原體、黑膠蟲污染后若細(xì)胞狀態(tài)尚可，可添加支原體清除試劑、“黑膠蟲"清除試劑培養(yǎng)2-3代觀察細(xì)胞狀態(tài)；若細(xì)胞污染后狀態(tài)很差，建議消殺后丟棄。
交叉污染應(yīng)立即停止使用該細(xì)胞系，對于已經(jīng)污染的細(xì)胞系，應(yīng)全部丟棄，并重新從原始來源或可靠的細(xì)胞庫獲取新的細(xì)胞株。
2、排查污染來源
污染通常來源于操作、試劑和耗材三個環(huán)節(jié)，應(yīng)逐一排查：
操作因素：檢查近期無菌操作是否規(guī)范，例如培養(yǎng)基瓶口是否長時間敞開？操作過程中衣袖或手臂是否越過開放容器？超凈臺使用前是否提前滅菌？實驗人員的衣著是否規(guī)范？使用移液器過程中槍頭是否觸碰過非無菌表面等。
試劑因素：將當(dāng)前使用的培養(yǎng)基及其他試劑（如血清、PBS、胰酶等）取適量分別放在干凈的器皿里，并置于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2-3 d，觀察是否出現(xiàn)渾濁、沉淀或顏色異常的情況，并在顯微鏡下檢查是否存在微生物污染，以評估試劑是否受到污染及是否可繼續(xù)使用。
耗材因素：檢查培養(yǎng)瓶、離心管、槍頭等耗材包裝是否完好、是否在有效期內(nèi)，并確認(rèn)使用前已完成無菌處理。
3、環(huán)境消殺
確認(rèn)污染源后，應(yīng)及時對相關(guān)區(qū)域進(jìn)行徹di消毒。
使用75%的酒精擦拭操作臺、生物安全柜及儀器設(shè)備表面。
采用甲醛（40%）10 mL/m2，高錳酸jia5 g/m2，熏蒸細(xì)胞實驗室。
所有接觸過污染細(xì)胞的培養(yǎng)瓶、移液管、槍頭等，須經(jīng)高壓蒸汽滅菌后再丟棄至醫(yī)療廢物桶，避免造成二次擴散。
相比污染后的補救措施，規(guī)范的日常管理才是控制細(xì)胞污染zui有效的方法。
01規(guī)范人員管理
進(jìn)入實驗室必須穿隔離衣、戴口罩等防護(hù)用品。
盡量減少人員頻繁出入細(xì)胞實驗室。
加強實驗人員培訓(xùn)，規(guī)范無菌操作流程。
02加強環(huán)境管理
每天上班操作前和下班后，均需對細(xì)胞間進(jìn)行紫外消毒；每隔一段時間需對實驗室的整體環(huán)境進(jìn)行熏蒸。
培養(yǎng)箱需定期消毒滅菌。
無菌操作臺使用前需打開紫外燈消毒至少30 min，實驗后需用75%的酒精擦拭臺面并打開紫外燈照射30min。
可使用普諾賽®細(xì)胞房安全衛(wèi)士和水浴鍋安全衛(wèi)士等商品化產(chǎn)品進(jìn)行日常污染預(yù)防。
實驗廢棄物需進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后，再丟棄至醫(yī)療廢物桶。
03嚴(yán)格執(zhí)行細(xì)胞實驗室規(guī)章制度
不斷完shan無菌實驗室的規(guī)章制度，加強無菌實驗室的管理規(guī)范。外來進(jìn)修人員、實習(xí)學(xué)生等進(jìn)入實驗室前要進(jìn)行相關(guān)的細(xì)胞操作培訓(xùn)和教育，掌握bi備的基本理論、實驗技能、操作規(guī)范，在帶教老師的指導(dǎo)下進(jìn)行實驗操作。
細(xì)胞污染是養(yǎng)細(xì)胞路上繞不開的坑，不要看到污染就全盤放棄，也不要抱著僥幸心理硬救。精準(zhǔn)識別污染類型，科學(xué)應(yīng)急處置，把預(yù)防做在前面，才能遠(yuǎn)離污染翻車，不讓你的努力白白消耗！
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